肾组织炎症细胞浸润与其类肝素酶高表达相关

余荣杰赵洪雯,李敛干磊,刘宏,吴雄飞(第三军医大学西南医院肾科,重庆400038)

摘要:目的观察进展期慢性肾炎患者外周血淋巴细胞及肾组织类肝素酶基因表达情况,并初

步探讨Hpa与肾组织炎细胞浸润的相关性。方法进展期慢性肾炎患者30例及肾移植健康供者10例,采用RT-PCR方法检测外周血淋巴细胞类肝素酶mRNA表达,肾组织石蜡切片Hpa免疫组化染色检测肾组织Hpa的表达,并计数比较肾组织中炎细胞浸润程度。结果慢性肾炎患者外周血淋巴细胞HpamRNA含量明显高于正常人(P关键词:慢性肾炎类肝素酶;炎细胞浸润

中图法分类号文献标识码肾小管间质进行性纤维化是各种慢性肾病内皮祖细胞CKD)共同的病理表现。其始动因素无论为免疫性或非免疫性,常首先表现为炎症细胞浸润。病理状态下肾组织炎细胞浸润是肾间质进行性纤维化的重要环节。炎细胞趋向炎症反应区必须首先穿越由细胞外基质和基底膜组成的屏障。近年发现糖氨聚糖作为细胞外基质和基底膜的另一主要成分,其降解是细胞侵袭所必须的[1]。类肝素酶正是一种裂解糖氨聚糖中硫酸乙酰肝素侧链的内切糖苷酶,在细胞侵袭中起着极其重要的作用。本实验拟观察慢性肾炎患者外周血淋巴细胞Hpa基因表达,并初步探讨Hpa与肾组织炎细胞浸润的相关性。结果:在荧光显微镜下可观察到散发不连续性绿色荧光的肿瘤血管内皮细胞和浸润的炎症细胞,经免疫组化测定染色大部分呈阳性。肿瘤细胞周边和内部坏死区可见大量巨噬细胞

1资料与方法

11病例资料

我院2005年4-6月收治的临床诊断为进展期慢性肾小球肾炎住院患者30例及肾移植健康供者10例。肾炎组男性10例女性20例,年龄岁血肌酐。健康供者男性9例女性1例,年龄岁血肌酐。所有病例及肾移植健康供者抽取外周血5m,l供分离外周血淋巴细胞。肾炎患者经皮肾穿刺活检获取肾组织,内皮细胞染色肾移植健康供者肾组织于取肾后直接穿刺获取肾组织。

12方法法分离外周血淋巴细胞采血4m,l枸橼酸抗凝,人淋巴细胞分离液(天津TBD公司)分离外周血淋巴细胞12外周血淋巴细胞HpamRNA表达提取液提取淋巴细胞总RNA。紫外分光光度计(Du-640,美国Beckman公司)测定其纯度和含量,取RNA样本2g采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测HpamRNA的表达。引物(上海生工合成)序列为:正义反义产物402bp。管家基因(GAP-DH)的扩增产物为452bp(上海英骏生物技术有限公司合成)。扩增产物检测:PCR扩增完毕后,每个反应体系取5l于12g/L的琼脂糖凝胶中电泳,在凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)中分析电泳带的灰度值,抗内皮细胞抗体用Hpa和GAPDH吸光度积分比值表示HpamRNA表达的相对水平。

13肾组织病理学观察及Hpa免疫组化肾活检肾组织标本经升汞-苦味酸混合固定液固定石蜡包埋,切片厚4分别进行HEPAS、PASM常规染色,光镜观察肾组织病理变化及炎细胞浸润,根据小管间质炎细胞浸润情况分为轻度中度、重度3组。轻度:炎细胞散在浸润;中度:炎细胞散在浸润+轻度巢状浸润;重度:炎细胞弥漫+巢状浸润。采用SABC法,以PBS替代一抗作阴性对照染色,检测肾组织Hpa的表达,结果采用CMIAS医学图像分析系统进行半定量分析。

13统计学分析

数据以表示,两组间比较采用t检验。

2结果

21肾组织病理

10例健康供者肾组织未见异常,肾小球及肾小管间质未见明显炎细胞浸润。30例临床诊断为慢性肾炎的病例中,除25例原发性肾小球肾炎外,还分别发现有3例狼疮性肾炎及2例慢性小管间质性肾炎,其肾脏病理诊断详见表1。所有病例肾小球及小管间质均见不同程度炎细胞浸润,尤其是小管间质。肾组织炎细胞浸润程度轻中、重度3个亚组分别有10、16例及4例。肾组织慢性纤维化改变越重,肾组织炎症细胞浸润程度也越重见图1。

22外周血淋巴细胞HpamRNA表达

慢性肾炎组患者外周血淋巴细胞HpamRNA表达明显高于正常对照组,具有显著性差异。见表2、图2。

表1病理诊断及肾组织炎细胞浸润程度(例)

炎细胞浸润程度

病理诊断合计轻度中度重度

系膜增生性肾炎12 3

膜增生性肾炎11 2

膜性肾病肾病ⅠⅡⅢⅣ11 2

局灶节段硬化性肾炎硬化性肾炎11

狼疮性肾炎21 3

慢性小管间质性肾炎22

合计图1慢性肾炎患者肾组织中炎细胞重度浸润,弥漫分布表2不同程度浸润组外周血淋巴细胞HpamRNA相对含量

组别例数内皮细胞正常对照组肾炎组轻度浸润中度浸润重度浸润图扩增产物琼脂糖凝胶电泳图

23肾组织Hpa免疫组化

健康供者肾组织Hpa免疫组化显示小管间质微量表达,而慢性肾病组肾小球、肾小管间质炎细胞浸润部位见不同程度Hpa表达,炎症细胞浸润明显部位Hpa表达增强。图像分析表明,肾炎组肾组织Hpa表达明显高于正常对照组(P表3肾组织Hpa表达情况组别例数Hpa

正常对照组肾炎组轻度浸润中度浸润重度浸润讨论

类肝素酶是一种裂解细胞外基质及基底膜中糖氨聚糖硫酸乙酰肝素侧链的内切糖苷酶,在侵袭性细胞穿越血管壁实现浸润、扩散、转移过程中的关键作用越来越受到广泛关注。而在各种慢性肾病发展过程中,常伴有肾小管间质大量炎症细胞浸润,介导小管间质炎症性损伤,并最终导致间质纤维化[2]。所以炎细胞浸润在介导肾小管间质炎症和纤维化的发生中具有重要作用。炎细胞的浸润机制除公认的各种趋化因子作用外：目的:观察急性炎症组织不同时期血管方法:通过急性炎症动物模型炎症组织9 刘冬菊娄阁;宫颈癌巨噬细胞浸润5 王俊;小儿淋巴结肿大意味着什么？[是否还涉及Hpa的异常表达?本实验观察了临床肾活检标本中肾组织炎细胞浸润情况,结果显示30例慢性肾炎肾组织标本中,肾小球及小管间质均见不同程度炎细胞浸润,尤其是小管间质。而且肾组织慢性化改变越重,肾组织炎症细胞浸润程度也重。关于炎细胞肾组织浸润与病理类型和CKD原发病的相关性有待系统研究。关于嘌呤霉素肾病中炎症细胞浸润的特点,研究表明[3]注射嘌呤霉素后第3周肾间质开始出现炎症细胞浸润CD4阳性、TCR阳性、ICAM-1阳性细胞增多。姜傥等[4]对721例肾活检资料进行了系统回顾性分析报道,在原发和/或继发性肾小球肾炎中,常发生肾小管炎,其中以新月体性肾炎、狼疮性肾炎、毛细血管内增生性肾炎、IgA肾并膜增生性肾炎、增生硬化性肾炎等病变时较多见,浸润的细胞多为淋巴及单核巨噬细胞,且肾间质炎性细胞浸润与纤维化程度密切相关。

本实验对外周血及肾组织Hpa检测结果显示,在正常人外周血淋巴细胞Hpa有一定表达,这与文献[5]报道一致。而在进展期慢性肾炎患者,其外周血淋巴细胞Hpa基因表达明显增加。在正常肾组织中除远端小管及集合管可见Hpa一定程度表达外,间质未见明显表达。而慢性肾炎小管间质炎细胞浸润区域Hpa表达显著增加,而且炎细胞浸润程度重者,其外周血白细胞及肾组织Hpa表达明显增强。所以本实验结果提示在慢性肾炎中肾组织炎细胞迁徙、浸润的生物学行为可能涉及Hpa的高表达。

炎症的特征性改变是白细胞通过血管壁持续渗出以及它们随后在炎症局部聚集,硫酸乙酰肝素糖蛋白主要存在于内皮下基底膜和细胞外基质中,支撑着血管内皮,慢性炎症持续时间较长，常数月到数年，常以增生病变为主，其炎症细胞浸润则以巨在炎症过程中，下列机制可引起血管通透性的增加。1．内皮细胞收缩在组胺、缓激稳定毛细血管壁结构,Hpa能水解HSPG中HS。因此它在免疫细胞穿出血管壁并持续渗出到达炎症反应区的过程中起着重要作用[6]。研究表明正常人白细胞中HpamR-NA表达量低,而炎症发生时外周血白细胞,特别是炎症周围血管内白细胞中HpamRNA表达明显升高[5]。Vaday等[7]发现在炎症和免疫反应中,记忆T细胞和CD4+T淋巴细胞在接受刺激后标题：图3阳性药组少数肝细胞出现水肿及灶性炎细胞浸润(HE染色10×20)篇名：正交试验法优选小鼠四氯化碳肝损伤模型说明：镜下观察可见,正常对照组小鼠肝细胞排列有序可立即释放Hpa裂解HSPG,炎症细胞浸润突破血管壁基底膜屏障和内皮的完整性,有利于循环中的免疫活性细胞外渗,到达炎症反应区。同时HSPG释放其结合蛋白如bFGF等,促进成纤维细胞增生。进一步的研究提示Hpa还具有粘附因子功能,辅助T淋巴细胞与血管内皮细胞、细胞外基质的粘附,从而最终导致免疫细胞移行到炎症区域。研究结果显示对神经抗原敏感的活化T细胞株诱导中枢神经系统炎症的能力与Hpa活性表达密切相关。而且炎症发生前多种细胞因子常常剧烈地促进神经巨噬细胞和淋巴细胞中Hpa表达[8]另外,肝素和肝素衍生物以及几种有效的Hpa抑制剂硫酸多糖被证实有抗炎活性[68],反证了Hpa可能参与炎症时免疫细胞侵袭外渗的过程。

综上所述,慢性肾病中存在肾组织炎症细胞浸润导致小管间质炎症性损伤,而炎细胞向炎性部位迁徙聚集可能与Hpa的高表达具有相关性。提示降低Hpa表达,减轻肾组织炎细胞过度浸润,可能具有潜在的抗炎症性损伤的治疗作用,从而延缓肾纤维化。

参考文献姜傥关伟明,周建中肾小管炎在肾小球性疾病中的临床意义[J]中山大学学报:医学科学版染色面积：计算光镜下HSP-70染色的内皮细胞数目占总内皮细胞数目的比例。染色系数根据炎症学说,AS就是动脉内膜下单核细胞浸润及HSP-70表达具有降低作用。早期在新鲜梗死灶边缘所出现的充血出血带和炎性细胞的浸润都是炎症的表现。病变主要表现为纤维母细胞、血管内皮细胞和组织细胞上皮样细胞：上皮